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DLin-DMA的衍生發展史

更新時間:2023-09-06   點擊次數:1002次

DLin系列

本(ben)實驗中,研究人(ren)員采(cai)用(yong)了一種合理的(de)(de)(de)方(fang)法來設(she)計陽離(li)子脂質(zhi)(zhi),并制(zhi)(zhi)(zhi)備(bei)用(yong)于(yu)遞(di)送小干擾RNA(siRNA)的(de)(de)(de)配(pei)方(fang)。以穩定核酸脂質(zhi)(zhi)顆粒(SNALP)的(de)(de)(de)關(guan)鍵脂質(zhi)(zhi)成分1,2-二(er)甲醇氧基(ji)-3-二(er)甲基(ji)氨基(ji)bing烷(DLinDMA)為(wei)例,研究人(ren)員利用(yong)所(suo)提出的(de)(de)(de)可電離(li)陽離(li)子脂質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)體(ti)內(nei)作用(yong)機制(zhi)(zhi)(zhi)來指導設(she)計具有優異遞(di)送能(neng)力的(de)(de)(de)基(ji)于(yu)DLinDMA結構拓展的(de)(de)(de)脂質(zhi)(zhi)。通(tong)過篩選后,對性(xing)能(neng)好的(de)(de)(de)脂質(zhi)(zhi)(DLin-KC2-DMA),進(jin)行(xing)了SNALP配(pei)制(zhi)(zhi)(zhi)和表征,并在嚙齒類動物(wu)(wu)和非人(ren)靈長類動物(wu)(wu)中分別(bie)在低至(zhi)0.01 mg/kg和0.1 mg/kg的(de)(de)(de)siRNA劑量下(xia),證明具有體(ti)內(nei)活性(xing)。研究發(fa)現(xian),DLin-KC2-DMA介導的(de)(de)(de)基(ji)因沉默比(bi)以前(qian)關(guan)于(yu)體(ti)內(nei)內(nei)源性(xing)肝臟(zang)基(ji)因沉默的(de)(de)(de)報道有了實質(zhi)(zhi)性(xing)的(de)(de)(de)改進(jin)。

表1.1 基于(yu)DLin-DMA的結構設計(ji)

圖1.1. 新型陽離子脂質的(de)體內評(ping)價(jia)

(a). DLinDAP的沉默活性(▼), DLinDMA(▲), DLin-K-DMA(■) 和DLin KC2-DMA(●)在小鼠FVII模型中的篩選。所有LNP siRNA系統都是使用預成型囊泡(PFV)方法制備的,由可電離的陽離子脂質、DSPC、膽固醇和PEG脂質(40:10:40:10mol/mol)組成,FVII siRNA/總脂質的比例約為0.05(wt/wt)。
(b). 頭群擴展對DLin-K-DMA活性的影響。DLin-K-DMA(■)在DMA頭基和縮酮環連接體之間添加了額外的亞甲基,以生成DLin-KC2-DMA(●),DLin-KC3-DMA(▲)和DLin-KC4-DMA(▼)在小鼠因子VII模型中評估每種脂質的制劑活性。

表1.2 含有(you)新型脂質的(de)LNPs的(de)生物物理參數(shu)和體內(nei)活性

鑒(jian)于正電(dian)荷(he)在(zai)指導(dao)脂(zhi)質(zhi)(zhi)設計的(de)(de)(de)(de)(de)作用機制假(jia)說中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)重要性,在(zai)DLin-K-DMA作為新的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)準(zhun)(zhun)(zhun)脂(zhi)質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)綜述中(zhong)研(yan)究了(le)胺基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)頭(tou)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)結構變化的(de)(de)(de)(de)(de)影(ying)響。進行了(le)一系列頭(tou)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)修飾、表征和測試,以探(tan)索大小、酸離(li)解常數和可電(dian)離(li)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)團(tuan)數量的(de)(de)(de)(de)(de)影(ying)響(補充合(he)成2和補充表2)。所測試的(de)(de)(de)(de)(de)pai嗪基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)、ma啉基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)、三甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)氨(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)或雙二甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)氨(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)修飾并不優于DLin-K-DMA的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)準(zhun)(zhun)(zhun)二甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)氨(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)頭(tou)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)。作為附加參數,通過引入額外的(de)(de)(de)(de)(de)亞甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)來改(gai)變二甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)氨(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)和二氧wu環連接(jie)體之間的(de)(de)(de)(de)(de)距離(li)。該距離(li)可以影(ying)響胺頭(tou)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)pKa以及電(dian)荷(he)呈現相對于脂(zhi)質(zhi)(zhi)雙層界面(mian)的(de)(de)(de)(de)(de)距離(li)和柔(rou)性。相對于DLin-K-DMA,將單個(ge)額外的(de)(de)(de)(de)(de)亞甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)插入頭(tou)部基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)團(tuan)(DLin-KC2-DMA)產生效力的(de)(de)(de)(de)(de)顯著(zhu)增加。在(zai)FVII模(mo)型中(zhong),這種脂(zhi)質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)ED50約為0.1 mg/kg,使其效力比DLin-K-DMA高4倍,比DLinDMA基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)準(zhun)(zhun)(zhun)高10倍。然而,具有額外亞甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)系鏈的(de)(de)(de)(de)(de)進一步(bu)延(yan)伸(shen)顯著(zhu)降(jiang)低(di)了(le)活(huo)性,DLin-KC3-DMA的(de)(de)(de)(de)(de)ED50約為0.6 mg/kg,DLin-KC4-DMA的(de)(de)(de)(de)(de)ED50>3 mg/kg。

圖(tu)1.2. 基于DLin-K-DMA,延長頭部基團碳鏈長度對粒徑及ED50的影響

圖1.3. KC2-SNALP對嚙齒類動(dong)(dong)物(wu)和非人類靈長類動(dong)(dong)物(wu)的療效

(a) 相(xiang)對(dui)于(yu)在小鼠中(zhong)(zhong)測(ce)試的(de)(de)初(chu)始(shi)篩選(xuan)制劑,KC2-SNALP的(de)(de)療(liao)(liao)效得到改善。KC2-SNALP的(de)(de)體內療(liao)(liao)效(○) 與小鼠因子VII模型中(zhong)(zhong)未優化的(de)(de)DLin-KC2-DMA篩選(xuan)(即PFV)制劑(●)的(de)(de)結果(guo)進行比(bi)較。數(shu)據點以PBS對(dui)照動物(wu)(wu)的(de)(de)百分比(bi)表示(shi),代表組平(ping)均值(zhi)(n=5)±s.d.(b)KC2-SNALP在非人(ren)靈(ling)長類動物(wu)(wu)中(zhong)(zhong)的(de)(de)療(liao)(liao)效。食蟹猴(每組n=3)接受(shou)0.03、0.1、0.3或1 mg/kg siTTR,或1 mg/kg在KC2-SNALP或PBS中(zhong)(zhong)配制的(de)(de)siApoB的(de)(de)總劑量,通過頭(tou)靜脈靜脈輸注15分鐘(zhong)(5 ml/kg)。給藥后48小時對(dui)動物(wu)(wu)實(shi)施an樂死(si)。在肝臟樣品中(zhong)(zhong)測(ce)定TTR mRNA水平(ping)相(xiang)對(dui)于(yu)GAPDH mRNA水平(ping)。數(shu)據點代表組平(ping)均值(zhi)±s.d.*,P<0.05;**,P<0.005。

表1.3 含有KC2的(de)SNALP的(de)體(ti)內活(huo)性

總結,研究人員將一種合理的方法應用于新型陽離子脂質的設計,這些脂質被篩選用于基于LNPsiRNA遞送系統。脂質結構分為三個主要功能元(yuan)(yuan)件(jian):烷(wan)基(ji)鏈、連(lian)接(jie)基(ji)和頭基(ji)。以(yi)DLinDMA為起點,通過保持(chi)其他兩(liang)個(ge)元(yuan)(yuan)素不變(bian),以(yi)系(xi)統的(de)(de)方(fang)(fang)式(shi)研究了(le)這些元(yuan)(yuan)素中(zhong)每一(yi)個(ge)的(de)(de)影響。首先,建立了(le)烷(wan)基(ji)鏈,然后(hou)改(gai)變(bian)了(le)連(lian)接(jie)體(ti),最后(hou),探索了(le)不同(tong)的(de)(de)頭基(ji)結構(gou)。使(shi)用(yong)這種方(fang)(fang)法,描述(shu)了(le)可(ke)離子化陽(yang)離子脂質的(de)(de)重要結構(gou)-活性考慮因(yin)素,并(bing)鑒(jian)定(ding)了(le)相(xiang)對(dui)于(yu)DLinDMA基(ji)準具有(you)改(gai)進活性的(de)(de)脂質。性能好的(de)(de)脂質(DLin-KC2-DMA)的(de)(de)SNALP制劑(ji)在嚙齒(chi)類(lei)(lei)和非人類(lei)(lei)靈(ling)長(chang)類(lei)(lei)動(dong)物中(zhong)都具有(you)良好的(de)(de)耐受性,并(bing)且在嚙齒(chi)類(lei)(lei)動(dong)物中(zhong)在低至0.01mg/kg的(de)(de)siRNA劑(ji)量下表(biao)現出(chu)體(ti)內活性,并(bing)且在非人類(lei)(lei)靈(ling)長(chang)目動(dong)物中(zhong)表(biao)現出(chu)治療顯(xian)著基(ji)因(yin)(TTR)的(de)(de)沉默。盡管目前的(de)(de)工(gong)作(zuo)范圍僅限于(yu)體(ti)內肝臟遞送,但(dan)與之前關于(yu)LNP siRNA介(jie)導的(de)(de)非人靈(ling)長(chang)類(lei)(lei)動(dong)物沉默的(de)(de)報道相(xiang)比,這項(xiang)工(gong)作(zuo)中(zhong)實(shi)現的(de)(de)TTR沉默(ED50~0.3 mg/kg)代表(biao)了(le)活性的(de)(de)顯(xian)著提高

試驗2

MC3最大(da)限度地提(ti)高siRNA脂(zhi)質納米(mi)顆粒在體(ti)內用于(yu)肝(gan)臟基因沉默的效力[2]

pKa的考察


圖(tu)2.1.TNS熒光法測(ce)定pKa

如(ru)圖2所(suo)示,四種可電離(li)陽(yang)離(li)子脂質的(de)pKa的(de)測定實例(li)。pKa的(de)取值,定義(yi)為在(zai)一半最大熒光強度下的(de)pH值。(A). 14,pKa=4.17;(B). 52,pKa=5.73;(C). 19,pKa=6.95;(D). 48,pKa=8.12。

圖2.2. 小鼠體內肝(gan)臟(zang)基因沉默活性與pKa的關系圖

將56個可電離陽離子脂質配制成(cheng)LNP,并進行ED50分析,根據它們(men)的pKa,繪(hui)制得到圖4。有(you)15種脂質,沒有(you)達到ED50劑量。剩余的脂質,通過(guo)最佳(jia)擬(ni)合曲線突出(chu)顯示(shi)了(le)具有(you)活性的化合物(wu),其表現(xian)出(chu)在(zai)6.2和6.5之間的最佳(jia)pKa

表(biao)2.1. 56種可電離(li)陽離(li)子脂質的設計及其ED50,pKa值(zhi)考察



圖(tu)2.3. 小鼠肝臟基因(yin)沉默活性圖(tu)

pKa在(zai)4-8.5之間,計算質(zhi)(zhi)子(zi)(zi)化/未質(zhi)(zhi)子(zi)(zi)化可電(dian)離(li)(li)陽離(li)(li)子(zi)(zi)脂質(zhi)(zhi)的電(dian)離(li)(li)程(cheng)度(%摩爾分數)。每個FVII ED50數據點(藍色)來源(yuan)于四劑(ji)量反應(每個劑(ji)量水(shui)平n=4只小(xiao)鼠(shu))。假(jia)設pH為(wei)7.4,在(zai)血液中攜帶正電(dian)荷的陽離(li)(li)子(zi)(zi)脂質(zhi)(zhi)顯示為(wei)紅色,而在(zai)pH為(wei)5.5的酸(suan)性內涵體中不帶電(dian)的陽離(li)(li)子(zi)(zi)脂質(zhi)(zhi)的顯示為(wei)綠色。

圖2.4.支持pKa值作為決定(ding)可(ke)電離(li)(li)陽離(li)(li)子脂質,體內肝臟(zang)基(ji)因(yin)(yin)沉默(mo)活性的主導(dao)因(yin)(yin)素。

可電離陽離子(zi)脂質(zhi)(zhi)15、16和(he)17的混合(he)物使所得LNP的平(ping)均(jun)表面pKa值在5.64和(he)6.93之間遞(di)增移位。括號中(zhong)的數字(zi)表示(shi)混合(he)物中(zhong)陽離子(zi)脂質(zhi)(zhi)的摩爾比(氨基脂質(zhi)(zhi)組(zu)分)。


圖2.5.可(ke)電離陽離子脂(zhi)質(16,DLin-MC3-DMA)的siRNA-LNP在小鼠和非人類靈長(chang)類動物(wu)中的功效。

在本研究中(zhong)使用了含有(you)50摩爾%的(de)16(DLin-MC3-DMA)的(de)經過優化后的(de)制劑組(zu)合(he)。相對于(yu)具有(you)約0.005 mg.kg-1的(de)中(zhong)值(zhi)有(you)效siRNA劑量(ED50)的(de)生理鹽水(shui)對照組(zu),小鼠(shu)血清(qing)中(zhong)的(de)殘余FVII活性;柱狀圖代表(biao)平(ping)均值(zhi)(n=5)給予食蟹(xie)猴0.03、0.1和0.3mg.kg-1劑量的(de)靶(ba)向TTR基(ji)因的(de)siRNA。線(xian)型圖則表(biao)示平(ping)均值(zhi)(n=3),以TTR mRNA表(biao)示,相對于(yu)肝(gan)臟樣本中(zhong)測(ce)定的(de)GAPDH mRNA水(shui)平(ping),ED50估計為(wei)<0.03 mg.kg-1。


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